Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes

Pour les articles homonymes, voir Fret (homonymie).

Le transfert d'énergie entre molécules fluorescentes ou transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET, acronyme de l'anglais Förster resonance energy transfer), bien qu’observé par Perrin au début du XX^e siècle, est décrit pour la première fois par Förster en 1946. Les applications de cette approche à l’étude des interactions protéiques apparaîtront vers la fin du XX^e siècle^[1].

Figure 1. Conditions du FRET. A. Un FRET peut apparaître seulement si le spectre d’émission du donneur recouvre le spectre d’excitation de l’accepteur. Ce recouvrement est défini par une intégrale de recouvrement J. B. Un FRET est observé si la distance séparant les deux fluorophores est inférieure à 1.8 x le rayon de Förster (R₀ ). Ce dernier définit la distance donneur – accepteur pour laquelle l’efficacité du transfert d’énergie est de 50 %. C. Importance de l’orientation relative des dipôles du donneur et de l’accepteur pour la mise en place d’un transfert d’énergie.

Conditions du transfert d’énergie

D’après la théorie de Förster, le FRET est défini comme un transfert d’énergie non radiatif (sans émission de lumière) résultant d’une interaction dipôle – dipôle entre deux molécules (donneur et accepteur d’énergie)^[2]. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d’émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d’absorption de l’accepteur (Figure 1.A). Ce recouvrement des spectres est défini par une intégrale appelée intégrale de recouvrement J(λ) :

$J = \int f_{\rm D}(\lambda) \, \epsilon_{\rm A}(\lambda) \, \lambda^4 \, d\lambda$

où f_D est l’intensité de la fluorescence émise par le donneur à une longueur d’onde donnée et $\epsilon_{\rm A}$ le coefficient d’extinction molaire de l’accepteur. Le facteur J reflète donc la capacité d’une paire de fluorophores à émettre et absorber de l’énergie à la même longueur d’onde.

En accord avec la théorie de Förster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur, comme le montre la formule suivante :

$E=\frac{1}{1+(R/R_0)^6}\!$

où R est la distance effective qui sépare les deux molécules et R₀ le rayon de Förster. Ce dernier correspond à la distance donneur - accepteur pour laquelle l’efficacité du transfert d’énergie est de 50% (Figure 1.B). Cette distance, qui dépend de la nature des fluorophores utilisés, est généralement comprise entre 1 et 10 nm^[3]. Au-delà de cette gamme, l’efficacité du transfert d’énergie chute très rapidement. L’expression mathématique pour le calcul de cette distance s’écrit :

${R_0} = (10^{-3} \; \kappa^2 \, n^{-4} \, Q_D \, J)^{1/6}\times9730$

où J est l’intégrale de recouvrement, n l’indice de réfraction du milieu (n ^{− 4} est généralement compris entre 1/3 et 1/5), Q_D le rendement quantique du donneur en absence d’accepteur et κ² le facteur d’orientation qui est fonction de l’orientation relative des dipôles du donneur et de l’accepteur (Figure 1.C). Même si la valeur de κ² est théoriquement comprise entre 0 et 4, 2/3 est la valeur habituellement utilisée pour déterminer le R₀. En effet, κ² est assimilé à 2/3 lorsque le donneur et l’accepteur présentent un degré de liberté suffisant pour être aléatoirement orientés dans l’espace^[2]. Cette condition est généralement satisfaite pour les fluorophores attachés à des biomolécules car ils peuvent avoir une certaine liberté de rotation^[4].

Caractéristiques photophysiques d'un fluorophore

Une molécule capable d’émettre un signal de fluorescence est qualifiée de fluorophore. Différentes caractéristiques photophysiques permettent de le définir :

- les spectres d’excitation et d’émission. Ils représentent la signature de la structure énergétique du fluorophore. La différence de longueur d’onde séparant leur maximum s’appelle le déplacement de Stokes.

- le coefficient d’extinction molaire (ε). Il correspond à la capacité d’absorption par le fluorophore de l’énergie apportée par un photon à une longueur d’onde donnée.

- le rendement quantique (Φ). Il caractérise la capacité du fluorophore à re-émettre sous forme de lumière, l’énergie absorbée. Il est défini comme étant le rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés.

- la durée de vie de fluorescence (τ). Elle représente le temps de séjour moyen du fluorophore dans son état excité.

Voir aussi l'article sur la fluorescence.

Comment mettre en évidence le FRET ?

Le FRET mesure des intensités. Expérimentalement, ce signal peut être mesuré à l’aide d’un fluorimètre ou en microscopie. Dans un fluorimètre, le signal de FRET mesuré provient d'une population cellulaire disposée dans des puits de taille différente selon les microplaques utilisées. En revanche, les techniques microscopiques mesurent des évènements de transfert d’énergie à l’échelle subcellulaire. Quel que soit le type de détection choisi, la mesure d’un FRET entre deux fluorophores peut être effectuée de différentes manières.

La première consiste à quantifier les variations de l’intensité de fluorescence en mesurant la diminution de la fluorescence du donneur^[5], l’augmentation de celle de l’accepteur ^[6] ou en calculant un rapport que nous appellerons ratio (fluorescence d’émission de l’accepteur/fluorescence d’émission du donneur)^[7]. Cette analyse est réalisable aussi bien en microplaque qu’en microscopie. La principale difficulté d’analyse de ces signaux vient du recouvrement pouvant exister entre les spectres d’excitation et d’émission des fluorophores utilisés. Ce manque de sélectivité spectrale est à l’origine d’un important bruit de fond avec comme conséquence une réduction de la sensibilité du test. Des couples de fluorophores tels que la fluorescéine/rhodamine ou les protéines CFP (Cyan fluorescent protein) / YFP (Yellow fluorescent protein) présentent ce type de limitation^[8]. Cependant, le signal sur bruit du FRET peut être amélioré en s’affranchissant d’une partie des signaux parasites grâce à une lecture en temps résolu. Ceci est possible en TR-FRET (Time-Resolved Förster Resonance Energy Transfer) grâce à l’utilisation de fluorophores à durée de vie longue tels que les chélates ou cryptates de terre rare (europium, terbium). À ce jour, le TR-FRET est appliqué uniquement dans des formats microplaques.

D’autres méthodes permettent de déterminer indirectement l’existence d’un FRET par photoblanchiment (pbFRET). Le photoblanchiment est une méthode qui consiste à éteindre un fluorophore par une exposition prolongée à une source lumineuse. La mise en œuvre de cette approche est préférable en microscopie confocale car il est ainsi possible d’obtenir une bonne résolution spatiale pour éteindre directement les fluorophores dans leur environnement cellulaire.

Dans le cas du FRET par photo-blanchiment (pbFRET), le photoblanchiment du fluorophore donneur entraîne une diminution de son intensité de fluorescence qui est mesurée en présence ou non d’accepteur. Lorsque l’accepteur est en étroite proximité avec le donneur, un FRET apparaît et entre en compétition avec le processus de photoblanchiment. Cette compétition se traduit par une augmentation de la résistance du donneur au photoblanchiment dont les constantes de temps mesurées (en présence ou non d’accepteur) permettent de mettre en évidence un transfert d’énergie ^[9].

Une autre alternative au pbFRET du donneur est le pbFRET de l’accepteur aussi appelé DFRAP pour donor fluorescence recovery after acceptor photobleaching. Les émissions de fluorescence du donneur et de l’accepteur sont mesurées avant et après photoblanchiment de l’accepteur. L’augmentation de la fluorescence du donneur après destruction de l’accepteur est argument pour prouver l’existence d’un FRET entre les deux molécules^[10],[11]. L’exemple de la Figure 2 illustre ce principe. Dans cette expérience une protéine de fusion formée de deux protéines auto-marquantes, SNAP-tag et CLIP-tag (self-labeling protein tag), est exprimée à la surface de cellules HEK293T via un ancrage par une hélice alpha transmembranaire (Figure 2A).

Figure 2. Retour de fluorescence du donneur d'énergie par photoblanchiment de l'accepteur. A. Principe. B. Spectres d'émission et d'absorption du donneur (AlexaFluor 488) et de l'accepteur (Cyanine 5). C. Images de cellules HEK293T (membranes plasmiques) obtenues en microscopie confocale (Zeiss LSM700). Rouge: Cy5, Vert: Alexa488. D. Variation de l'intensité de fluorescence du donneur et de l'accepteur au cours du photoblanchiment.

Ces protéines de 20 kDa, toutes deux dérivées de l’O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase humaine (AGT), sont respectivement marquées de manière spécifique avec des composés de type O6-benzylguanine (BG) et O2-benzylcytosine (BC) portant un fluorophore. La protéine SNAP-tag est marquée avec un dérivé BG-AlexaFluor 488 (Alexa488) et la protéine CLIP-tag avec un dérivé BC-Cyanine 5 (Cy5) (Figure 2A). La forte proximité entre les fluorophores au sein de la protéine de fusion ainsi que le recouvrement du spectre d’émission du donneur (Alexa488) avec le spectre d’absorption de l’accepteur (Cy5) (Figure 2B, surface hachurée) sont deux conditions favorables à l’établissement d’un transfert d’énergie intramoléculaire (Figure 2A). Ce transfert d’énergie peut être mis en évidence par l’augmentation du signal de l’Alexa488 (500 - 600 nm) après photoblanchiment du Cy5 (Figure 2C, 2D). Dans cette expérience l’accepteur a été complètement photoblanchi c’est-à-dire jusqu’à ce que son signal (650 - 700 nm) après photoblanchiment se trouve au niveau du signal provenant de cellules voisines non transfectées (bruit de fond). L’efficacité du transfert d’énergie E_A dans cette expérience de photoblanchiment de l’accepteur peut être calculée à partir de la formule suivante :

E_A = F^D_post – F^D_pre / F^D_post = E × α × β

F^D_post représente le signal du donneur après photoblanchiment de l’accepteur et F^D_pre représente le signal du donneur avant photoblanchiment de l’accepteur. α est la fraction de donneur interagissant avec l’accepteur et β la fraction d’accepteurs photoblanchis par rapport à la fluorescence initiale de l’accepteur avant photoblanchiment (100% dans cette expérience). Comme il s’agit ici d’une protéine de fusion avec en tandem les deux protéines SNAP-tag et CLIP-tag portant respectivement le fluorophore donneur et accepteur (rendement de marquage de SNAP-tag et CLIP-tag = 100%), la valeur de α est égale à 1. De fait, la valeur de l’efficacité du FRET mesurée est égale à l’efficacité du FRET réelle. Dans cette expérience l’efficacité du FRET a été calculée à partir de la moyenne des mesures réalisées sur 30 cellules différentes. La valeur obtenue pour E est de 39 ± 6 % (± standard déviation). En ignorant les possibles changements d’orientation relatifs des moments dipolaires de l’émission du donneur et de l’absorption de l’accepteur on peut déterminer la distance apparente entre les deux fluorophores, d = 60 Å (ångström).

Plus généralement le DFRAP utilise la paire de protéines fluorescentes CFP/YFP. Cependant des travaux publiés en 2005 ont permis de mettre en évidence que le photoblanchiment de la YFP s'accompagne de l'apparition d'un signal de fluorescence dans le canal de la CFP et cela en absence de CFP^[12]. Ces travaux montrent aussi que la Citrine et la Venus peuvent, après photoblanchiment, générer des espèces présentant une émission similaire à celle de la CFP. Le mécanisme de conversion de la eYFP, Citrine et Venus en CFP-like n'est à ce jour pas connu.

L’utilisation de la durée de vie de fluorescence du donneur est aussi une approche adaptée à la mesure des évènements de FRET. Cette méthode consiste à mesurer le déclin de fluorescence du donneur au cours du temps. Cela peut être réalisé aussi bien sur des populations de cellules au format microplaque, que par des techniques microscopiques. La base physique de cette approche repose sur le fait que la durée de vie d’une molécule fluorescente dépend notamment de l’efficacité du processus de FRET. Par conséquent, plus le transfert d’énergie entre les deux molécules est efficace plus le déclin de fluorescence du donneur est rapide. Le FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) est un exemple de technologie basée sur l’analyse de durée de vie^[13]. Il est préférable avec ce type d’approche d’utiliser des molécules fluorescentes dont le déclin de fluorescence est monoexponentiel. La CFP par exemple est utilisée en FLIM en dépit de certains désavantages dus à son faible rendement quantique, son faible coefficient d’extinction molaire et surtout à son déclin de fluorescence qui présente deux exponentielles^[14]. Ainsi, afin de faciliter l’analyse des durées de vie en FLIM des mutations de cette protéine ont permis de générer un variant nommé Cerulean plus lumineux que la CFP et présentant une décroissance monoexponentielle^[15].

Utilisation de la GFP et de ses dérivés en FRET

Figure 3. Les protéines GFP. A. Structure cristallographique de la GFP (code pdb : 1EMB). B. Spectres d’excitation et d’émission des variants de la GFP.

L’innovation probablement la plus importante dans le domaine des fluorophores fut marquée par la découverte d’une protéine fluorescente pouvant être directement encodée à l’intérieur de la cellule. Il s’agit de la GFP (Green Fluorescent Protein). L’exploitation de la GFP et la génération de variants de cette protéine ont permis le développement de technologies de FRET parfaitement adaptées à l’étude de la dynamique des interactions moléculaires dans l’espace et dans le temps à l’intérieur de cellules vivantes.

Initialement identifié chez la méduse Aequorea victoria, le gène codant la GFP a été cloné en 1992 par Prasher et coll. Cristallisée pour la première fois en 1974, il faudra attendre 1996 pour obtenir la structure tridimensionnelle de la GFP par diffraction de rayons X^[16]. Cette protéine de 27 kDa se présente sous forme d’un cylindre de 30 Å (Ångström) de diamètre et 40 Å de hauteur composé de onze feuillets β (9 à 13 résidus par feuillet) qui entourent une hélice α contenant le chromophore (Figure 2.A). Le chromophore résulte d'une réaction spontanée de cyclisation des chaînes latérales de trois acides aminés (Sérine65 – Tyrosine66 – Glycine67) à l’intérieur du tonneau. L’organisation des feuillets β en formant une véritable cage, confère au chromophore son propre environnement^[17].

La photoactivation de cette protéine dont le pic d’absorption majoritaire est à 395 nm entraîne une réaction autocatalytique provoquant l’émission d’une lumière verte avec un pic d’émission à 508 nm. Différentes protéines mutantes de la GFP ont été produites. En changeant, entre autres, la structure des trois acides aminés formant le chromophore, il a été possible de modifier les longueurs d'onde d'absorption et d'émission de la GFP devenant alors, une BFP (Blue Fluorescent Protein), une YFP (Yellow Fluorescent Protein) ou de nombreux autres variants bien caractérisés (CFP, RFP…) (Figure 3.B). L’utilisation de ces différents mutants comme sondes moléculaires en font des outils de choix aussi bien dans l’étude de l’expression de gènes, le suivi de protéines et leur compartimentalisation cellulaire que dans l’analyse des interactions protéine – protéine par des approches de transfert d’énergie. Concernant ce dernier point, deux paires de fluorophores ont été largement utilisées. Ces molécules BFP/GFP et CFP/YFP dérivées de la GFP présentent en effet des propriétés photophysiques compatibles avec la mise en place d’un transfert d’énergie.

Le point fort de cette technologie réside dans l’encodage des protéines fluorescentes. Il est donc possible de suivre en microscopie la localisation cellulaire des protéines avec une bonne résolution spatiale. De plus, grâce à la forte intensité de fluorescence des molécules utilisées, les phénomènes de transfert d’énergie peuvent être visualisés directement dans la cellule permettant de définir à la fois la nature des protéines en interactions, la dynamique de ces phénomènes et leur localisation cellulaire.

Dans le domaine des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) cette approche a été beaucoup utilisée pour caractériser la dimérisation des récepteurs (association par paire des protéines formant un récepteur fonctionnel). La fusion des GFP au niveau de la région carboxy-terminale des récepteurs a permis d’analyser leur organisation sans pour autant altérer leur structure, fonction ou localisation dans les travaux publiés. Le principal inconvénient de cette approche pour l’étude de la dimérisation vient de la nécessité de passer par la microscopie confocale. En effet, en microscopie classique par épifluorescence ou dans un fluorimètre il n’est pas possible de séparer le signal provenant des récepteurs de surface de celui des récepteurs retenus dans les compartiments intracellulaires. De plus, la difficulté de miniaturisation de cette approche en microplaque ne permet pas d’étendre ce type d’analyse à du moyen ou haut débit.

Utilisation du BRET

Article principal : BRET.

FRET en temps résolu

Généralités

La principale limite du FRET est liée au manque de sélectivité spectrale des fluorophores utilisés ainsi qu’à la difficulté de s’affranchir des signaux parasites (bruit de fond). Ceci a des conséquences sur la sensibilité des tests mis en œuvre. Ainsi, l’utilisation de traceurs présentant des propriétés originales de luminescence a permis de mettre au point des tests plus sensibles en améliorant la résolution spectrale et temporelle du signal de FRET. Ces molécules sont des complexes formés par l’association d’un chromophore (cryptand ou chélate) et d’un cation lanthanide faisant partie du groupe des terres rares (europium, terbium…). La principale caractéristique des lanthanides vient de leur durée de vie de luminescence relativement longue (de l’ordre de la milliseconde). La durée de vie de fluorescence de la plupart des fluorophores organiques et des protéines fluorescentes est de l’ordre de la nanoseconde, tout comme les fluorescences parasites (autofluorescence, diffraction de la lumière…). Grâce à cette propriété des ions lanthanides, les systèmes de détection de fluorescence en phase homogène et en temps résolu ont pu être développés. Ces systèmes reposent sur l’application d’un délai entre l’excitation de l’échantillon et la mesure du signal émis de manière à s’affranchir des fluorescences parasites à durée de vie courte. Cette résolution temporelle du signal permet ainsi d’améliorer le rapport entre le signal du traceur et le bruit de fond inhérent aux conditions du test sans qu’aucune étape de séparation des espèces ne soit nécessaire.

Fluorophores

Donneur

Figure 4. Les chélates et cryptates de lanthanide. A. Structure des chélates et cryptates de lanthanide. B. Transfert d’énergie entre le chromophore (chélate ou cryptate) et l’ion europium. C.I.S = croisement intersystème.

Au cours des années 1970, les complexes luminescents de lanthanides se sont révélés des candidats intéressants comme marqueurs dans le développement de systèmes d’analyse et de diagnostic. En effet, l’utilisation des chélates et cryptates de lanthanides a permis de mettre au point des systèmes de détection en temps résolu caractérisés par une réduction du bruit de fond. Chacune de ces sondes est constituée d’un chromophore organique et d’un lanthanide (principalement europium et terbium). La complexation de l’ion par le chélate est basée sur une interaction réversible alors que dans la structure du cryptate, le cryptand encage irréversiblement l’ion en le protégeant des interactions environnementales (extinction de fluorescence par les molécules d’eau…) (Figure 4.A). La présence de groupements réactifs au niveau du chromophore permet de greffer le complexe à des biomolécules (anticorps, antigènes, etc.). Une propriété intéressante de ces chromophores est leur capacité à collecter l’énergie excitatrice (effet d’antenne) et à la transférer sur le cation lanthanide. L’antenne est nécessaire du fait de la faible capacité d’absorption de la lumière par les lanthanides qui rend leur excitation directe difficile (< fluorophores organiques conventionnels). Ainsi, l’excitation du complexe de lanthanide par une lumière incidente (laser, lampe flash…) contribue à peupler les niveaux vibrationnels singulets de haute énergie du chromophore (transition S0 → S1, S2) (Figure 4.B). Le retour vers l’état fondamental S0 est influencé par la présence du lanthanide qui favorise le croisement intersystème permettant de peupler les états triplets (T1) du chromophore. Finalement, le passage T1 → S0 induit un transfert d’énergie favorisant le remplissage des niveaux excités du lanthanide (5D0 pour l’europium et 5D4 pour le terbium) dont la composante de désexcitation par voie radiative est responsable de l’émission luminescente.

Le transfert d’énergie intramoléculaire existant au sein de ces complexes est responsable du grand déplacement de Stokes (de l’ordre de 200 – 250 nm) qui permet de s’affranchir de l’interférence due à la source d’excitation. Ce décalage est la conséquence de la séparation des fonctions absorption (par le chromophore) et émission (par le lanthanide) au sein du complexe. Ainsi, les chromophores organiques (chélate, cryptate) absorbent majoritairement dans l’UV et la partie bleue du spectre visible alors que les lanthanides réémettent dans le vert – rouge : 560 nm pour le terbium et 605 nm pour l’europium. La longue durée de vie de cette émission (µs → ms) est principalement la conséquence des transitions électroniques particulières qui interviennent au niveau des terres rares. Cette caractéristique permet d’ailleurs l’utilisation de ces molécules dans des applications en temps résolu.

Dans les milieux biologiques classiquement utilisés, le complexe formé par le chélate et le lanthanide peut être dissocié en raison d’une faible stabilité de l’interaction (compétition entre l’ion lanthanide et les ions Mn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺ ou chélation du lanthanide par de l’EDTA), ce qui constitue un inconvénient. Dans le cas des cryptates de lanthanides l’inclusion de l’europium dans une cage tridimensionnelle formée par le cryptand empêche ces phénomènes de dissociation conférant au complexe une très haute stabilité.

Les cryptates de lanthanide sont les donneurs d’énergie utilisés dans la technologie HTRF (Homogeneous Time Resolved Fluorescence). La mise au point de leur structure découle des travaux de Jean-Marie Lehn, prix Nobel de chimie en 1987. Plusieurs types de cryptate d’europium ainsi qu'un cryptate de terbium ont été développés par la société CisBio International. Le cryptate de terbium (Lumi4-Tb™ ) développé récemment par cette société présente plusieurs avantages par rapport aux chélates de terbium et cryptates d'europium. D'abord son coefficient d'extinction molaire, ε = 20,000 M ^{− 1}cm ^{− 1}, est deux à trois fois plus important que celui des chélates de terbium, ε = 8,000 M ^{− 1}cm ^{− 1}, et cryptates d'europium, ε = 10,000 M ^{− 1}cm ^{− 1}. De plus, son large spectre d'absorption rend compatible l'utilisation du Lumi4-Tb™ avec une large gamme de sources d'excitation (lampes flash, laser au nitrogene etc.).

Accepteur

Les cryptates d’europium sont des fluorophores qui peuvent être utilisés pour des applications de FRET avec des accepteurs d'énergie présentant des propriétés spectrales dans le proche infrarouge comme la Cyanine 5 (Cy5). Deux accepteurs de ce type ont été développés par la société CisBio International.

Le premier accepteur développé pour des tests HTRF est une phycobiliprotéine de 105 kDa, l’allophycocyanine purifiée et modifiée chimiquement (XL665) ^[18],[19]. Cette molécule présente une très bonne compatibilité énergétique avec le cryptate ce qui permet une importante efficacité de transfert^[20] (Figure 5). De plus, l’émission de la XL665 est maximale à 665 nm alors que l’émission du cryptate est très faible dans cette région. Enfin, cette molécule présente un bon rendement quantique (≈ 70%) et peut être couplée à diverses biomolécules par ses groupements amines.

Figure 5. Spectres d’absorption et d’émission de la XL665. A. Compatibilité énergétique entre le cryptate d’europium TBP et la XL665 (idem d2, Cy5…). B. Spectres d’émission du cryptate d’europium TBP et de la XL665.

La deuxième génération d’accepteurs est représentée par le d2, une petite molécule organique d’environ 1 kDa. Comme la XL665, le d2 est un accepteur fortement compatible avec le cryptate d’europium. D’autres molécules très semblables au d2 telles que l’AlexaFluor 647 ou le Cy5 sont aussi utilisables dans ce type de tests. La petite taille de ces molécules représente un avantage certain pour des tests biologiques en évitant notamment les problèmes d’encombrement stérique.

Le cryptate de terbium, comme le cryptate d'europium, peut être utilisé avec des fluorophores accepteurs d'énergie de type Cy5 mais il présente aussi l'avantage de pouvoir être associé à des accepteurs de type fluorescéine et des protéines fluorescentes (GFP).

Transfert d’énergie : sélectivité temporelle et spectrale

La grande sensibilité de détection de la technologie HTRF est la conséquence de l’analyse du signal de FRET en temps résolu (sélectivité temporelle) et d’une bonne séparation des spectres d’émission des molécules donneur et accepteur (sélectivité spectrale).

Sélectivité temporelle

Lors d’un transfert d’énergie entre un donneur possédant une durée de vie de fluorescence longue et un accepteur fluorescent, ce dernier émettra un signal de fluorescence présentant une durée de vie apparente similaire à celle du donneur^[21],[22]. Ainsi, l’utilisation des cryptates de terre rare permet de mesurer l’émission de fluorescence de l’accepteur en temps résolu (intégration du signal après un délai de 50 µs pendant 350 µs) (Figure 6.A). Cette propriété permet de distinguer la fluorescence de l’accepteur engagé dans un FRET (durée de vie longue) de la fluorescence de l’accepteur libre (durée de vie courte ~ ns) et des fluorescences parasites émises par les biomolécules présentes dans les milieux biologiques (~ ns).

Figure 6. Sélectivité temporelle, sélectivité spectrale et détection à double longueur d’onde. A. Détection du signal de FRET à 665 nm en temps résolu. B. Spectres d’émission de l’europium (donneur) et de l’accepteur XL665 (ou d2). Le rapport 665/620 permet de s’affranchir des interférences optiques entre les différents milieux.

Sélectivité spectrale

La sélectivité spectrale est obtenue grâce à une bonne séparation entre le pic d’émission de l’accepteur et les pics d’émission du cryptate d’europium. En effet, l’accepteur (d2, XL665) émet dans une zone où le cryptate n’émet quasiment pas (Figure 6.B).

Détection à double longueur d’onde

Dans la technologie HTRF, l’émission de fluorescence de l’accepteur à 665 nm est normalisée par celle du cryptate à 620 nm. Les deux longueurs d’ondes sont mesurées simultanément. Le calcul du rapport des intensités de fluorescence à 665 et 620 nm permet de s’affranchir des variations optiques entre les différents milieux. Dès lors, la valeur de ce rapport ne dépendra que des interactions biologiques (Figure 6.B). Pour le cryptate de terbium deux ratio peuvent être utilisés. Pour le couple Lumi4-Tb/d2 on choisira le ratio 665/620 comme précédemment alors que pour le couple Lumi4-Tb/fluorescéine ce sera le ratio 520/490. La robustesse de ce signal permet par exemple d’analyser le FRET dans des milieux biologiques complexes (sérum, cellules…) ou de tester des librairies dont les composés peuvent présenter de fortes absorbances.

Exemples d'application

La sensibilité et la robustesse du signal HTRF font de cette technologie une approche parfaitement adaptée à l’étude des interactions entre biomolécules dans des systèmes de criblage à haut débit tel qu'il est pratiqué dans l'industrie pharmaceutique. Ainsi, une large variété de tests permettant de détecter de nombreux évènements biologiques a pu être développée. Parmi ces gammes de produits, a été mis au point une série de kits de dosage de seconds messagers permettant de mesurer l’activation des protéines Gs, Gi et Gq couplées à des RCPG^[23],[24]. Cette même société a mis en place une nouvelle plateforme de criblage des interactions protéine-protéine à la surface cellulaire. Cette plateforme tire profit de l'utilisation de ligands fluorescents^[25] ainsi que de la technologie SNAP-tag ^[26] pour cibler spécifiquement des protéines d'intérêt (RCPG) avec des fluorophores donneur/accepteur, permettant une analyse des interactions protéine-protéine par FRET en temps résolu.

Transfert d’énergie intermoléculaire

Les techniques de transfert d’énergie, FRET (variants de la GFP, anticorps marqués…) ou BRET, ont été beaucoup utilisées pour démontrer des interactions protéines – protéines aussi bien à l’intérieur de la cellule qu’à la surface cellulaire. Quelle que soit la méthode choisie, cette démonstration repose sur la détection d’un signal caractéristique reflétant la forte proximité, si ce n’est l’association, des protéines cibles. Dans le domaine des récepteurs couplés aux protéines G, ces approches ont révélé l’existence de récepteurs membranaires homo- ou hétérodimériques et ont contribué à mieux comprendre les mécanismes intervenant au cours de l’activation des protéines G. Elles ont aussi permis de développer, entre autres, des sondes sensibles à des seconds messagers comme par exemple l’AMPc^[27]. En effet, l’AMPc en se fixant au niveau des sous-unités catalytiques et régulatrices de la PKA, entraîne une dissociation de ce complexe. Ainsi, en fusionnant les fluorophores au niveau des différentes sous-unités, il est possible de corréler directement la production d’AMPc intracellulaire à une diminution du signal de FRET.

Transfert d’énergie intramoléculaire (changements conformationnels)

Figure 7. Transfert d’énergie intramoléculaire : sonde calcique^[28].

Les techniques de transfert d’énergie sont des approches suffisamment sensibles pour mesurer des changements conformationnels intervenant au sein d’une protéine. Ceci est possible en incorporant les fluorophores donneur et accepteur à différentes positions de la protéine d’intérêt. Les points d’insertion sont choisis de manière à ce que les changements conformationnels, en modifiant la distance et/ou l’orientation des fluorophores, entraînent des modifications du transfert d’énergie (augmentation ou diminution).

Le transfert d’énergie intramoléculaire a permis d’analyser les changements conformationnels intervenant au cours des processus d’activation des récepteurs membranaires. Ainsi, Vilardaga et coll. ont analysé les réarrangements intracellulaires induits par la fixation de molécules agonistes et antagonistes au niveau des récepteurs béta-2A-adrénergiques et des récepteurs aux hormones parathyroïdiennes^[29]. Le même type d’analyse a permis d’étudier les changements conformationnels du récepteur aux androgènes^[30].

De nombreuses sondes intracellulaires ont aussi été développées sur ce principe. L’objectif de ces systèmes est de pouvoir révéler l’activation d’une voie de signalisation particulière en mesurant les variations de concentrations de différents seconds messagers. La première sonde fluorescente appelée caméléon, a été développée par Miyawaki et coll. afin de mesurer les modifications de la concentration calcique à l’intérieur de la cellule^[7] (Figure 7). Suite à la fixation de quatre ions calcium au niveau de son domaine calmoduline, la sonde subit des changements conformationnels provoquant un rapprochement des fluorophores. L’augmentation du signal de FRET à 510 (GFP) ou 535 nm (YFP) est dépendante de la production calcique intracellulaire. Il est ainsi possible de mesurer en temps réel, les variations de la concentration calcique à l’intérieur de la cellule. D’autres sondes ont aussi été développées pour mesurer notamment la concentration en GMPc (Nikolaev et al., 2006) ou pour détecter simultanément l’activité de la PKA et de la PKC^[31].

Notes et références

1. ↑ Selvin, 2000
2. ↑ ^{a et b} Stryer, 1978
3. ↑ Stryer and Haugland, 1967
4. ↑ Dale et al., 1979
5. ↑ Sokol et al., 1998
6. ↑ Chan et al., 1979
7. ↑ ^{a et b} Miyawaki et al., 1997
8. ↑ Zheng et al., 2002
9. ↑ Rocheville et al., 2000
10. ↑ Gregan et al., 2004
11. ↑ He et al., 2003
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Voir aussi

Bibliographie

• (en) J. R. Lakowitz, Principles of fluorescence spectroscopy, 2^ème édition, Kluwer Academic/Plenum publisher.

Articles connexes

• Fluorescence
• Microscope à fluorescence
• Redistribution de fluorescence après photoblanchiment